滅菌試験用途向けマイクロファンネルSTフィルターファンネルの存在/不在および回収試験プロトコル

1.0 目的

この試験は、マイクロファンネルSTフィルターファンネル製品が滅菌試験用途に適しており、このプロトコルで定義された薬局方収載の細菌を回収することを検証するためのものです。

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2.0 適用範囲

USP-24およびEP-2000にリストされた細菌を使用して、マイクロファンネル・フィルターファンネルの存在/不在試験 (直接移送) および微生物回収試験を行います。マイクロファンネルSTフィルターファンネルの3つのロットは、各細菌について3回試験されます。

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3.0 参考資料

3.1 USP24 <71> 滅菌試験

3.2 USP24 <1227> 薬局方条項の微生物回収のバリデーション

3.3 EP 2000 2.6.1. 滅菌

3.4 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater、19版、1995年


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4.0 サンプル要件

3つのロットそれぞれのマイクロファンネルSTフィルターファンネル150個。マイクロファンネルSTフィルターファンネルの各ロットは、各試験菌について3回評価されます。

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5.0 材質

5.1 試験菌

大腸菌、ATCC 8739

緑膿菌、ATCC 9027

黄色ブドウ球菌、ATCC 6538P

枯草菌、ATCC 6633

クロストリジウム・スポロゲネス菌、ATCC 19404 (またはクロストリジウム・スポロゲネス菌、ATCC 11437)

カンジダ・アルビカンス、ATCC 10231

黒色アスペルギルス、ATCC 16404

5.2装置

真空マニホールド

ボルテックスミキサー

インキュベーター、32.5 ± 2.5°Cおよび22.5 ± 2.5°C

45 ± 1°Cのウォーターバス

Quebecコロニーカウンター

ペトリ皿、15 X 100mmおよび15 X 150mm

ピペット、1mLおよび10mL、滅菌

ピペッター、1000 lambda

氷水浴

嫌気ジャーまたはパウチ

実体顕微鏡

5.3 メディアと試薬

ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト (SCD) 寒天培地

嫌気性菌用寒天培地

ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス、200mLボトル、滅菌

液状チオグリコレート培地 (FTM)、

200mLボトル、滅菌

生理食塩水 (0.9% NaCl)、滅菌

滅菌0.1%ペプトン水

滅菌生理食塩水TS

ポリソルベート80を0.05%添加

0.05~0.1%のツイーン80を含む滅菌0.1%ペプトン水


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6.0 手順

6.1 菌の準備

6.1.1 標準研究所基準に従って薬局方収載の細菌の培養を行います。

6.1.2 1mLあたりのコロニー形成単位密度が100より小さくなるように各細菌懸濁液を希釈します。無芽胞性好気性菌には滅菌生理食塩水を使用し、芽胞菌および真菌胞子懸濁液にはポリソルベート80を0.05%添加した滅菌生理食塩水TSを使用します。

6.2 ファンネルの分析

6.2.1 試験対象の1つのロットから3つのマイクロファンネルSTフィルターファンネルを取り出し、ユニットをマニホールドに直接取り付けます。または、#8栓を付けた青いアダプターを使用する場合があります。

6.2.2 滅菌洗浄液100mLを各マイクロファンネルSTフィルターファンネルに分注します。無芽胞性好気性菌には滅菌0.1%ペプトン水を使用し、芽胞菌および真菌胞子懸濁液にはツイーン80を0.1%添加した滅菌0.1%ペプトン水を使用します。フィルターファンネルのフタを交換して真空にし、液体を排出したら真空をオフにします。

6.2.3 ステップ6.2.2を繰り返します。

6.2.4 滅菌洗浄液100mLを各マイクロファンネルSTフィルターファンネルに分注します。無芽胞性好気性菌には滅菌0.1%ペプトン水を使用し、芽胞菌および真菌胞子懸濁液にはツイーン80を0.1%添加した滅菌0.1%ペプトン水を使用します。

6.2.5 1.0mLピペットまたは同等品を使用して、試験菌懸濁液1.0mLを各フィルターユニットに分注します。

6.2.6 フィルターファンネルのフタを交換して真空にし、液体を排出したら真空をオフにします。

6.2.7 1つ目のマイクロファンネルST試験ファンネルからメンブレンを取り出します。フタを取り外して、ファンネルシリンダー優しくひねってベースから外し、アルコールの炎にあてた鉗子を使用してメンブレンの端をそっと持ち上げます。有効ろ過面積に触れないよう注意してください。

6.2.8 メンブレンの下に気泡が入らないように転がしながら、表側を上にして、あらかじめ注いでおいた寒天平板培地の表面にメンブレンをつけます。好気性菌にはSCD寒天培地を使用し、クロストリジウム・スポロゲネス菌には嫌気性菌用の寒天平板培地を使用します。

6.2.9 6.2.7の説明と同じように、2番目のマイクロファンネルST試験ファンネルからメンブレンを取り外し、無菌手法によりメンブレンを200mLのFTMのボトルに沈めます。

6.2.10 6.2.7の説明と同じように、3番目のマイクロファンネルST試験ファンネルからメンブレンを取り外し、無菌手法によりメンブレンを200mLのSCDブロスのボトルに沈めます。クロストリジウム・スポロゲネス菌の場合は、SCDブロスに浸す必要はありません。

6.3 マイクロファンネルSTフィルターファンネルのロット内での試験の反復

6.3.1 回収および存在/不在の両方の方法によって、マイクロファンネルSTフィルターファンネルのロットごとに、3つの反復試験を実施します。

6.3.2 回収および存在/不在の両方の方法によって、マイクロファンネルSTフィルターファンネルの3つのロットの性能を評価します。

6.3.3 6.2に記載されているステップを繰り返して、マイクロファンネルSTフィルターファンネルの3つの各ロットの反復試験をすべて検証します。

6.3.4 6.2に記載されているステップを繰り返して、マイクロファンネルSTフィルターファンネルの3つの各ロットですべての細菌を3回評価します。

6.4 照合

6.4.1 接種数: ステップ6.1.2で準備した細菌懸濁液1.0mLを別の滅菌ペトリ皿に分注して、細菌懸濁液ごとに5~10枚の濃度調整プレートを準備します。約45~48°Cに冷却された溶けた寒天を約20mL追加し、渦巻状に両方向に数回慎重に混ぜてから、寒天を凝固させます。クロストリジウム・スポロゲネス菌には嫌気性菌用の寒天培地を使用し、それ以外の細菌にはSCD寒天培地を使用します。

6.4.2 培地性能照合: 試験で使用したように、該当する細菌または両方で使用したすべての培地 (ブロスと寒天) の各ロットに直接植菌します。セクション6.5の説明と同じように培養します。

6.4.3 メディア滅菌照合: 評価で使用したすべての寒天培地とブロス培地の各ロットの植菌されていない複製を2つ以上培養します。

6.4.4 洗浄液/メンブレンの陰性照合: 洗浄液の300mLの各ロットを4つのマイクロファンネル・フィルターファンネルでろ過します。1つのフィルターは嫌気性菌用寒天培地で培養し、1つのフィルターはSCD寒天培地で培養し、1つのフィルターはSCDブロスに浸し、最後のフィルターはFTMに浸します。セクション6.5と同じように培養します。使用したフィルターまたはマイクロファンネルのロットごとに、これらの照合を繰り返します。

6.4.5 洗浄液/メンブレンの陽性照合: 洗浄液として使用したペプトン水の300mLの各ロットを2つのマイクロファンネルSTフィルターファンネルでろ過し、1つをSCDブロスに浸し、もう1つをFTMに浸します。次に、試験菌懸濁液を植菌します。使用した細菌ごとに繰り返します。

6.5 培養

6.5.1 嫌気性菌用寒天平板培地を32.5 ± 2.5°Cの嫌気条件下で最長7日間培養します。定期的に増殖を確認し、コロニーがはっきりと視認できたらコロニー計数を実施します。メンブレン上のコロニーが見えるように実体顕微鏡を使用するか、または混釈平板の場合はQuebecカウンターを使用できます。

6.5.2 Incubate B. subtilus, C. albicans, and A. niger organisms cultured on SCD agar plates at 22.5 ± 2.5 °C for a maximum of 7 days.定期的に増殖を確認し、コロニーがはっきりと視認できたらコロニー計数を実施します。メンブレン上のコロニーが見えるように実体顕微鏡を使用するか、または混釈平板の場合はQuebecカウンターを使用できます。

6.5.3 Incubate E. coli, P. aeruginosa, and S. aureus organisms cultured on SCD agar plates at 32.5 ± 2.5 °C for a maximum of 7 days.定期的に増殖を確認し、コロニーがはっきりと視認できたらコロニー計数を実施します。メンブレン上のコロニーが見えるように実体顕微鏡を使用するか、または混釈平板の場合はQuebecカウンターを使用できます。

6.5.4 SCDブロス

6.5.4.1 Incubate SCD broth inoculated with E. coli, P. aeruginosa, and S.aureus organisms at 32.5 ± 2.5 °C for a maximum of 3 days.定期的に濁度を確認します。

6.5.4.2 Incubate SCD broth inoculated with B. subtilus, C. albicans, and A. niger at 22.5 ± 2.5 °C for a maximum of 5 days.定期的に濁度を確認します。

6.5.5 FTM

6.5.5.1 Incubate FTM inoculated with E. coli, P. aeruginosa, C. sporogenes, and S. aureus at 32.5 ± 2.5 °C for a maximum of 3 days.定期的に濁度を確認します。

6.5.5.2 Incubate FTM broth inoculated with B. subtilus, C. albicans, and A. niger at 22.5 ± 2.5 °C for a maximum of 7 days.定期的に濁度を確認します。


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7.0 結果

7.1 メンブレンフィルターから得られたコロニーのコロニー計数および形態学的特徴を記録します。

7.2 Quebecカウンターを使用して混釈平板からコロニー計数を行います。計数と記録については、「Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater」の最新版のセクション9215 A.8を参照してください。

7.3 FTMとSCDブロスの濁度を確認し、結果を記録します。試験サンプルの増殖が照合と同等であるかどうかについてコメントを記入します。

7.4 計算

7.4.1 マイクロファンネルST試験サンプルと照合メンブレンの細菌およびロットごとに平均数を計算します。

7.4.2 計算された平均ごとに標準偏差、σ、およびcVを計算します。
cV = ( σ ÷ x ) ( 100 )

7.4.3 SCD混釈平板濃度調整 (接種数) の平均と標準偏差を計算します。

7.4.4 マイクロファンネル・サンプルと照合メンブレンの回収率を計算します。

回収率 (%) =   メンブレンの平均   x 100

接種数の平均

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8.0 限界と結論

8.1 滅菌試験ファンネルとしての使用に適していると見なされるためには、マイクロファンネルST試験ファンネルの各ロットの回収率が濃度調整の70%以上である必要があります。

8.2 サンプルグループのcVが20%を超えている場合は、そのメディアでのそのグループの試験が無効と見なされ、試験を反復する必要があります。

8.3 メディア照合グループのcVが20%を超えている場合は、そのメディアでの試験全体 (すべての試験ファンネルと照合) が無効と見なされる可能性があります。

8.4 濃度平板のグループのcVが20%を超えている場合は、その特定の細菌懸濁液を使用した試験全体が無効と見なされる可能性があります。

8.5 存在/不在試験の場合は、試験ブロスでの増殖が照合ブロスでの増殖と同等になる必要があります。すべての試験サンプルですべての微生物について多量の増殖が見られた場合、その方法は検証済みと見なされます。

8.6 滅菌試験ファンネルとしての使用に適していると見なされるためには、マイクロファンネルST試験サンプルのロットごとにSCDブロスおよびFTMの植菌されたブランクのすべてについて濁度を観察する必要があります。

8.7 試験懸濁液をSCDブロスまたはFTMに直接植菌しても混濁結果が生じなかった場合、試験は無効になり、反復する必要があります。

8.8 陰性照合と陽性照合はすべて、所定の反応をもたらす必要があります。矛盾があれば報告します。


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注文情報

マイクロファンネルSTフィルターファンネル
製品番号 概要 孔径
4750 マイクロファンネルST、スーポア450メンブレン付き、プレーン、滅菌、100mL容量 0.45µm
4751 マイクロファンネル300 ST、スーポア450メンブレン付き、プレーン、滅菌、300mL容量 0.45µm
4811 マイクロファンネルST、GN-6 メトリセルメンブレン付き、グリッドあり、滅菌、100mL容量 0.45µm
4812 マイクロファンネル300 ST、GN-6 メトリセルメンブレン付き、プレーン、滅菌、300mL容量 0.45µm
パッケージについて:

100mLファンネル (1箱40ユニット入り): 1箱に個別包装済みファンネル10袋入りの大袋が4つ入っています。

300mLファンネル (1箱20ユニット入り): 1箱に個別包装済みファンネル5袋入りの大袋が4つ入っています。


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付随製品

フィルターファンネル マニホールド
製品番号 概要 パッケージ
15402 3ポート (アルミニウム製) 1/パッケージ
15403 6ポート (アルミニウム製) 1/パッケージ
82728 #8ゴム栓 1/パッケージ
その他
製品番号 概要 パッケージ
13158 吸引/加圧ポンプ、230V 1/パッケージ
13159 修理キットとスペアパーツ 1/パッケージ
13160 吸引ポンプ、115V 1/パッケージ
13161 吸引ポンプ、230V 1/パッケージ
4402 バキュシールド吸引ポンプ保護フィルター 3/パッケージ
51147 ステンレススチール製  ピンセット 1/パッケージ

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